第一次反共高潮结束以后，国民党将军事反共的重点南移，把反共目标指向敌后抗战的新四军，筹划新的反共高潮，同时加紧在国民党统治区进行反共活动，两党关系依然紧张。
1940年10月19日，国民政府军委会以参谋总长何应钦与副参谋总长白崇禧名义，签署致第18集团军正副总司令朱德、彭德怀和新四军军长叶挺的“皓电”，最后通牒江南新四军“限于电到一个月内”，“全部开到”黄河以北指定地区。由此，揭开了第二次反共高潮的序幕。
为了探明国民党当局的政治动向，了解各界人士对时局变化的反映，给中共中央作出正确对策提供依据，周恩来、博古、叶剑英等南方局领导人频繁接触冯玉祥、孙科、覃振、于右任、章伯钧、沈钧儒、黄炎培、左舜生等各方面人士，征求他们对“皓电”和时局的看法。10月24日，周恩来连续两次致电中共中央，提出“目前反共高潮正在着着上升”，提议“皓电”不能同意，但不能置之不理。军事上，一要将新四军主力开至江北，便于集结应战；二要主力立即分散，江北部队需作应战准备。为了使中共中央决策获得更充足的依据，11月1日，周恩来又两次致电中共中央，建议以朱德、彭德怀、叶挺、项英名义通电答复“皓电”，表示皖南新四军在有充分保障条件下可移至江北。中共中央最终采纳了周恩来的建议。11月9日，由毛泽东起草了以朱、彭、叶、项名义致何、白的“佳电”，经叶剑英转给国民党当局。“佳电”刚柔并济地批驳了“皓电”中对八路军、新四军的诬蔑不实之词，既顾全大局，又坚持原则，发布后得了国民党统治区广大中间派的理解和同情，使中共在政治上取得了主动。
12月25日，蒋介石约见周恩来，称新四军都是他的部下，只要“说出一条北上的路，我可担保绝对不会妨碍你们通过”。但“如果你们非留在江北免调不可”，“冲突绝难避免”。次日，周恩来给中央发电指出：蒋的承诺“靠不住”，这次不过是“吓压之余，又加上哄之一着”罢了，而事实上，国民党“局部‘剿共’仍在加紧布置中”。
1941年1月6日，奉命北移的新四军军部和直属部队9000余人，行至安徽泾县茂林地区，突遭国民党军8万余人包围袭击，“皖南事变”发生。大部分将士英勇牺牲，军长叶挺被扣，副军长项英等遇害。1月7日，周恩来得到皖南新四军遭袭消息，当即向国民党联络代表张冲提出强烈抗议。1月11日，周恩来在参加《新华日报》创刊3周年庆祝晚会时，再一次收到有关事变急电，他当即向与会各界宣布，强烈谴责了顽固派罪行，指出：“黑暗只是暂时的，光明一定会到来。” 1月17日，周恩来在获悉蒋介石宣布取消新四军番号后，即在曾家岩50号给何应钦打电话，义正词严地指出：“你们的行为（动）使亲者痛，仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”当晚，周恩来在红岩办事处二楼走道召集南方局、办事处人员开会，通报事变发生经过。指出：目前时局发展有两种可能，一是国共完全决裂；二是国民党不敢全面反共，但经过斗争两党还可继续合作抗日。而我们则应从最坏的可能准备，争取最好的结果。次日凌晨，周恩来奋笔写下“为江南死国难者致哀！”和“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急！？”的题词与挽诗。《新华日报》连夜刊印，在天亮前发往全城，使事变真相大白天下。
1月19日，南方局印发《新四军皖南部队惨被围歼真相》传单，并广为散发。1月20日，中共中央军委发布重建新四军军部命令，同日，毛泽东以中共中央革命军事委员会名义发表谈话，揭露顽固派反共阴谋，要求国民党废止一党专政，实行民主政治。周恩来通过国民党联络代表张冲，及时将上述“命令”和“谈话”转交国民党中央。随即，宋庆龄、柳亚子、何香凝、陈友仁等在香港发出抗议，并致函蒋介石。国统区中间党派也愤然抗议，章伯钧等与周恩来会面，表达准备成立民主联合会，团结各中间党派、无党派人士，与中共加强合作，共同推进民主改革和反对内战的意愿。
国民党内也不乏反对内战者，张治中向蒋介石呈万言书，痛陈对中共问题处理失策，认为“皖南事变”是招致两党破裂的开始，关系至大。国民参政会秘书长的王世杰，向蒋介石面陈慎重处置新四军问题，以免造成内战危险及国际间的不良观感。国共谈判联络代表张冲，在事变发生后“感到没脸见人”。他对周恩来说：一朝中总有秦桧、岳飞，我们是忠，他们（指亲日派）是奸。尤其是时任国民党军委会副委员长的冯玉祥，在军委会政治部第二次国际问题座谈会所作演讲中，以波兰与法国不和而导致亡国的教训，呼吁国共两党珍视民族团结，且对国民党顽固派制造分裂提出警告。
与此同时，经过南方局外事组的工作，美、英、苏等驻华使馆以及国际机构也了解了事变真相，逐渐对中共倾于同情和支持。苏联驻华大使潘友新指出：中国内战意味着灭亡。1月下旬，英国驻华大使卡尔与周恩来会晤后将事件真相报告本国政府，英国政府即电告蒋介石，指出内战只会加强日军的攻击。2月中旬，美国总统特使居里与周恩来秘密会见不久，便向蒋介石声明：“美国政府在国共纠纷未解决前，无法大量援华”。
1941年2月初，二届国民参政会召开在即，为抗议国民党制造的系列反共事件，中共参政员拒绝出席这次会议。3月2日，中共参政员董必武、邓颖超致函国民参政会，提出承认中共和中间党派以及陕甘宁边区合法地位、释放“皖南事变”被捕人员等12条作为出席会议条件。中共的坚决态度，赢得中间势力拥护和支持，最终迫使蒋介石在二届参政会上作出“以后决无剿共之军事”的承诺。
至此，在中共中央领导下，周恩来等南方局领导人经过与国民党顽固派的反复较量，达到了以斗争求团结，维系合作抗战大局的目的。
